Protocole général pour une identification de protéine dans un gel
Préparation de l'échantillon
Les bandes de gel nous sont généralement acheminées déjà extraites d'un gel de polyacrylamide. En premier lieu, nous lavons la ou les bandes de gel à l'aide de plusieurs cycles successifs de déshydratation/hydratation en utilisant de solvants gradés pour le MS. En second lieu, les ponts S-S sont détruits à l'aide d'un agent réducteur, puis bloqués par alkylation. Vient ensuite la digestion des protéines directement dans le gel à l'aide d'une protéase. Finalement, nous purifions les peptides résultant de la digestion à l'aide d'une technique appelée extraction en phase solide, ou SPE. L'échantillon est alors prêt à être analysé par LC-MS/MS.
Analyse LC-MS/MS
Avant d'entrer dans le spectromètre de masse, les peptides sont séparés par un système de chromatographie liquide (LC). Cet appareil est directement connecté au spectromètre de masse et permet de décomplexifier d'avantage l'échantillon. La séparation additionnelle apportée par le LC permet d'approfondir énormément les capacités de séquençage du MS puisque les peptides entrent dans l'appareil séquentiellement, plutôt que simultanément. Une fois à l'intérieur du MS, les peptides sont fragmentés à l'aide d'un gaz. Ces fragments sont alors acheminés vers le détecteur à haute résolution de l'appareil qui en mesure la masse en utilisant un mode d'acquisition appelé DDA, pour "data dependent acquisition". Ce procédé génère une liste de masse d'ions précurseurs ainsi qu'une liste de fragments associés à chaque précurseur.
Analyse de données et identification de protéine
Afin d'identifier quelle(s) protéines étaient dans l'échantillon, nous chargeons les fichiers du spectromètre de masse dans un logiciel. Essentiellement, ce logiciel associe la liste de masses enregistrée par l'appareil à plusieurs peptides, puis les distribue ces peptides à une protéine. Il est possible d'identifier diverses modifications post-traductionelles et/ou des substitutions d'acides aminés.
Rapports de données
Les rapports de données sont fournis en format Excel et incluent une liste de protéines probablement identifiée, un score d'identification et le nombre de peptides associés à ces protéines. Nous allons également inclure l'analyse de FDR générée par le logiciel lors de l'analyse.
