Il est parfois nécessaire de confirmer la séquence complete d'une protéine. En utilisant une combinaison de plusieurs protéases et de spectrométrie de masse, nos experts pourront déterminer exactement la séquence en acide aminé de votre protéine d'intérêt.
La première étape pour confirmer la séquence en acide aminé d'une protéine est de la digérer en peptides à l'aide d'une protéase. La protéase de choix pour la majorité des protocoles de protéomique est la trypsine, puisqu'elle clive de manière spécifique après chaque lysine et arginine (avec quelques exceptions). Cependant, certaines protéines contiennent des régions pauvres en lysines et arginines. La cartographie peptidique est donc impossible dans ces régions en n'utilisant que la trypsine, puisque les peptides générés sont trop gros pour être séquencés. Pour palier à ce problème, nos experts procéderont à la digestion in silico de votre protéine d'intérêt avec plusieurs protéases, de manière à générer des peptides identifiables sur 100% de la séquence. Nous arrivons généralement à couvrir 100% de la séquence en utilisant 2 à 3 protéases différentes.
Lorsque le choix des protéases est arrêté, votre protéine sera réellement digérée. Les peptides provenant de chaque digestion seront alors purifiés et analysés sur un court gradient LC-MS/MS en utilisant un mode d'acquisition appelé DDA (pour "data dependent acquisition").
Les fichiers d'acquisition seront chargés dans un logiciel d'identification de protéine. Ce logiciel attribuera une séquence et un score à chaque peptide enregistré par le spectromètre de masse, pour chacune des digestions. Par la suite, nous mettrons en commun les peptides identifiés dans chaque digestion et pourrons confirmer la séquence complète de la protéine d'intérêt.
Les rapports de cartographie peptidique comprennent la liste de tous les peptides identifiés par notre appareil, séparés par protéase. Nous fournissons également la couverture totale de la protéine, en plus d'indiquer la certitude attribuée à chaque acide aminé.